前言

(相關(guān)資料圖)

抗體偶聯(lián)藥物（ADC）是由靶向特異性抗原的單克隆抗體與小分子細(xì)胞毒性藥物通過連接子鏈接而成，兼具傳統(tǒng)小分子化療的強(qiáng)大殺傷效應(yīng)及抗體藥物的腫瘤靶向性。ADC由三個主要部分組成：負(fù)責(zé)選擇性識別癌細(xì)胞表面抗原的抗體，負(fù)責(zé)殺死癌細(xì)胞的藥物有效載荷，以及連接抗體和有效載荷的連接子。

ADC對抗原的識別導(dǎo)致ADC通過內(nèi)吞途徑進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，通過溶酶體降解后，有效載荷以生物活性形式釋放并發(fā)揮作用，導(dǎo)致癌細(xì)胞死亡。細(xì)胞內(nèi)有效載荷的數(shù)量由每個細(xì)胞表面抗原的數(shù)量、每個ADC的藥物有效載荷分子的數(shù)量（也稱為藥物抗體比率，DAR）以及抗原返回細(xì)胞表面所需的時間決定。有效載荷可能在癌細(xì)胞死亡和降解后逃逸，也可能從胞漿中透膜而出。這種釋放的后果可能是有益的（也稱為旁觀者效應(yīng)），也可能是有害的，導(dǎo)致全身毒性。

抗體工程在10年間也已經(jīng)取得了相當(dāng)大的進(jìn)展，允許更多的位點特異性偶聯(lián)，提高了ADC的均一性和穩(wěn)定性。新的第二代和第三代ADC已經(jīng)進(jìn)入臨床，以期獲得更好的治療效果和安全性。幾十種基于半胱氨酸殘基、非天然氨基酸或分子工程模式的生物偶聯(lián)技術(shù)也已經(jīng)在臨床前研究獲得了驗證。此外，更多的腫瘤特異性抗原靶點和腫瘤內(nèi)細(xì)胞毒性藥物的釋放機(jī)制使ADC獲得了爆炸式的發(fā)展，ADC藥物進(jìn)入了黃金時代。

有效載荷

1． 微管破壞藥物

金盞花素

Auristatins是ADC中使用的重要有效載荷，最著名的家族成員MMAE存在于兩種上市藥物Adcetris和Polivy中。目前，超過10種以金盞花素（如MMAE）或一甲基金盞花素F（MMAF）為有效載荷的ADC正在進(jìn)行臨床試驗。

上圖描述了auristatine及其常用的連接位點。金盞花素的構(gòu)效關(guān)系（SAR）已被廣泛研究，主要集中在末端亞單位：P1（N－末端）和P5（C－末端），最常見的方法是在P1上引入氨基甲酸酯功能。

2015年，西雅圖遺傳學(xué)的研究人員將ADC有效載荷的范圍擴(kuò)大到包括叔胺，特別是N－二甲基auristatine，首次通過銨鍵將藥物與單克隆抗體結(jié)合。所得ADCs在生理條件下穩(wěn)定，體內(nèi)外活性高，免疫特異性強(qiáng)。這些結(jié)果擴(kuò)大了ADC可用于靶向給藥的藥物種類。

最近，Agensys公司通過調(diào)節(jié)中心亞基P2－P3－P4，將疊氮化物基團(tuán)引入P2和P4亞基，在與蛋白酶可裂解的連接子偶聯(lián)后，產(chǎn)生了在體外和體內(nèi)效力提高的親水性衍生物，這為連接子的連接提供了新途徑。

一般來說，在同時含有胺和醇反應(yīng)的auristatin中，首選的連接點是胺通過氨基甲酸酯鍵偶聯(lián)。西雅圖遺傳學(xué)開發(fā)了一種新的策略，將含醇的有效載荷與亞甲基烷氧基氨基甲酸酯（MAC）偶聯(lián)。為了穩(wěn)定MAC鍵，堿性基團(tuán)和吸電子基團(tuán)都靠近氨基鍵，結(jié)果表明，該偶聯(lián)物在生理條件下是穩(wěn)定的，具有很高的效價，并且在體內(nèi)外都具有免疫特異性。

此外，烏普薩拉大學(xué)的研究人員還開發(fā)了AZASTATIN，作為一類新的強(qiáng)有力的auristatin衍生物，包含一個中心胺側(cè)鏈的抗體結(jié)合位點。他們的研究結(jié)果證實，這些auristatin衍生物是一類新的細(xì)胞毒性有效載荷，適合ADC開發(fā)。

美登素衍生物（DM2，DM4）

美坦辛是一種非常有效的微管組裝抑制劑，可誘導(dǎo)細(xì)胞的有絲分裂停止。但是這種結(jié)構(gòu)很難共軛，因為它沒有反應(yīng)性官能團(tuán)，為了克服這個問題，一系列含有SMe基團(tuán)的非常有效的衍生物被創(chuàng)造出來。這一類分子的第一個例子是DM1和DM4，它們帶有甲硫丙?；皇翘烊籒－乙?；?/p>

從有效載荷DM1和DM4中，通過使用二硫鍵與連接子偶聯(lián)。穩(wěn)定的二硫鍵連接子在血液循環(huán)中表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性，同時在細(xì)胞內(nèi)保持有效的分裂。

此外，幾種基于maytansine的ADC利用相同的二級羥基作為附著點，并在大多數(shù)情況下攜帶轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶生物結(jié)合的連接子。例如，一種基于Daratumumab的ADC被證明能向CD38過度表達(dá)的癌細(xì)胞特異性地傳遞DM4。最近ImmunoGen開發(fā)了一種新型的ADC，它包含一種含硫的maytansinoid，通過一種高度穩(wěn)定的三肽連接體連接到抗體上，附著點與上述羥基相同。與先前的美登素ADC相比，增加連接物中亞甲基單元的數(shù)量增加了旁觀者殺傷活性，并提高了小鼠體內(nèi)的療效。在類似的方法中，保持核心大環(huán)不變，Regeneron和Abzena的研究人員研究了N－甲基丙氨酸氮取代的影響，也改變了大環(huán)上側(cè)鏈的長度，以及通過伯胺和仲胺連接的連接子。

微管溶素

Tubulysins是微管聚合的有效抑制劑，可導(dǎo)致分裂細(xì)胞的細(xì)胞骨架迅速解體，并導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。它們是一個天然存在的四肽家族，含有Mep、Ile、Tuv和Tut，R3＝OH或Tup，R3＝H。

利用Tubulysins作為ADC有效載荷，其廣泛的附著點已被充分開發(fā)。這種結(jié)構(gòu)中一個明顯的附著點是Tut或Tup模塊的羧酸，如Endocyte的EC1428，其中羧酸通過酰肼部分連接到連接子。Oncomatryx公司也采用了同樣的方法，以同樣的方式安裝了可切割的PABAValCit馬來酰亞胺連接子。

阿斯利康、百時美施貴寶和輝瑞使用的另一種方法依賴于Tup或Tut中苯環(huán)的衍生化。

連接子與Mep基團(tuán)的連接也得到了廣泛的研究。Ingenica研究人員報告說，去甲基Mep類似物保留了強(qiáng)大的細(xì)胞毒性活性，可被視為有價值的有效載荷，允許在仲胺上引入不可切割的馬來酰亞胺己基連接子。

Oncomatryx的研究表明，當(dāng)Mep被另一個擁有仲胺的基序取代時，通過氨基甲酸酯鍵引入可切割的連接體是產(chǎn)生ADC的有效途徑。特別有趣的是，基因泰克關(guān)于通過季銨基團(tuán)將連接子連接到含叔胺的有效載荷上。在有效載荷上引入mc－Val－Cit－PABA連接子導(dǎo)致更多親水性結(jié)合物并改善了血液中的穩(wěn)定性。西雅圖遺傳學(xué)也采用了同樣的方法，通過過度表達(dá)葡萄糖醛酸，葡萄糖醛酸連接子也可以改善親水性和選擇性的細(xì)胞內(nèi)切割通過癌細(xì)胞中過表達(dá)的β－葡萄糖醛酸酶。

隱粘菌素

隱粘菌素（Cryptomycins，CR）是一個具有抗腫瘤活性的六元大環(huán)二肽家族。已有的臨床試驗的結(jié)果表明，在達(dá)到治療效果所需的劑量下，其毒性水平是不可接受的。

幾個小組嘗試將CR用于ADC，但是由于在CR中缺少偶聯(lián)位點，目前，有兩種不同的方法通過引入其它基團(tuán)，使得能夠連接ADC的連接子。一種是由基因泰克的研究人員將苯轉(zhuǎn)化為芐胺以產(chǎn)生有效的有效載荷，這種有效載荷適合通過氨基甲酸酯鍵連接。在第二種方法中，四川大學(xué)的研究人員利用了隱霉素－52的前藥形式（CR55），它可以在生理條件下重新環(huán)化為CR52。

抗有絲分裂EG5抑制劑

紡錘體驅(qū)動蛋白（KSP，也稱為Eg5或KIF11）是一種ATP依賴性運動蛋白，參與細(xì)胞周期中心體的分離。因此，用KSP抑制劑（KSPis）阻斷有絲分裂中的這一重要事件可產(chǎn)生抗腫瘤效力。

拜耳發(fā)現(xiàn)了一個新的吡咯亞類的KSPis，他們研究了該分子不同位置與保持對KSP強(qiáng)親和力的連接子的連接兼容性。

同樣，諾華的研究人員使用含咪唑的KSP抑制劑作為Eg5 ADC。利用伯醇或仲酰胺部分，他們安裝了帶有馬來酰亞胺端基的不可裂解連接子。當(dāng)與靶向HER2和c－KIT的抗體偶聯(lián)時，得到的ADC顯示出優(yōu)于Kadcyla的體內(nèi)療效。

2． DNA損傷藥物

吡咯苯并氮卓類和吲哚氯苯并氮卓類

吡咯并［2，1－c］［1，4］苯二氮雜卓（PBD）是一類具有抗腫瘤活性的天然產(chǎn)物。它們的作用方式是在DNA的小凹槽中進(jìn)行選擇性烷基化，其中鳥嘌呤的N2與PBD上的親電N10／C11亞胺形成共價鍵。

西雅圖遺傳學(xué)使用SGD1882的苯胺作為附著點，模仿可切割連接子中常用的PAB單元，釋放自由的PBD有效載荷。StemCentrx與Spirogen合作，利用PBD的N－10位置連接一個氨基甲酸酯的連接子。同樣的氨基甲酸酯鍵也被Immunogen用于結(jié)構(gòu)相似的吲哚氯苯偶氮卓二聚體（IBD）有效載荷。他們還報道了同一類IBD的不同方法，其中一個取代的苯環(huán)被用作兩個IBD單體的C8／C8＇位置之間的連接物。

以類似的方法，Spirogen和Genentech設(shè)計了一種碘苯連接的PBD，允許在過渡金屬催化反應(yīng)中引入不同的連接子。通過使用Sonogashira偶聯(lián)、Buchwald–Hartwig偶聯(lián)或疊氮化物－炔烴點擊反應(yīng)，分別獲得炔烴、哌嗪或三唑連接的連接子有效載荷共軛物。

杜卡霉素

杜卡霉素是一種強(qiáng)大的細(xì)胞毒性物質(zhì)，通過其高活性的環(huán)丙烷環(huán)與DNA的小凹槽結(jié)合，并在N3位置烷基化腺嘌呤。非環(huán)化的，鹵甲基形式的杜卡霉素細(xì)胞毒性活性顯著降低。由于分子中苯酚基團(tuán)可作為內(nèi)消旋體激活劑，從而形成親電環(huán)丙烷，因此杜卡霉素ADC開發(fā)中的連接策略集中于酚官能團(tuán)的連接子連接。

在Synthon開發(fā)的SYD985中，苯酚基團(tuán)是通過雙氨基甲酸酯連接連接子與Mc－val－cit－PABC有效載荷的位置。組織蛋白酶B裂解后，游離苯酚促進(jìn)分子內(nèi)重排成親電環(huán)丙基形式。Medarex采用了一種不同的方法，通過分子非烷基化部分的芳香胺連接連接子，并用N－甲基哌嗪氨基甲酸酯部分掩蔽苯酚前藥。在體內(nèi)，苯酚將被釋放，隨后活性環(huán)丙烷將在羧酸酯酶的作用下形成。

喜樹堿

喜樹堿（CPT）及其衍生物是拓?fù)洚悩?gòu)酶I抑制劑的經(jīng)典例子。它們穩(wěn)定了拓?fù)洚悩?gòu)酶誘導(dǎo)的DNA單鏈斷裂，當(dāng)三元DNA－TOP1－抑制劑復(fù)合物遇到復(fù)制叉時，DNA發(fā)生雙鏈斷裂。天然喜樹堿是一種五環(huán)結(jié)構(gòu)，其極低的溶解性阻止了其作為癌癥治療藥物的廣泛應(yīng)用。其水溶性前藥伊立替康獲得了轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌的上市許可。SN－38是伊立新坦的活性代謝物，通過人體肝臟羧酸酯酶的作用在體內(nèi)生成，其可通過打開內(nèi)酯環(huán)而失活。

Immunomedics建立了兩種不同的策略，通過其羥基部分結(jié)合SN－38。在一個例子中，連接子通過反應(yīng)性更強(qiáng)的C－10苯酚基團(tuán)連接，從而產(chǎn)生穩(wěn)定的氨基甲酸酯鍵，而在另一個例子中，通過C－20羥基，同時穩(wěn)定內(nèi)酯形式，而C－20羥基對體內(nèi)效力至關(guān)重要。

另一種適合ADC的非常有效的藥物是依沙替康（DDX－8951f）。這種喜樹堿類似物在其環(huán)己烷環(huán)上具有胺取代基，橋接7和9位。依沙替康的氨基有助于其水溶性，而環(huán)己烷環(huán)賦予的剛性被認(rèn)為有利于活性內(nèi)酯形式與非活性水解羥基酸的平衡。氨基羥基乙酰化生成DXd（1），而4－氨基丁?；蒁Xd（2），這兩種化合物都保留了依沙替康的生物活性。

懸垂的羥基和氨基是明顯的附著點，可使用酶可切割的Gly－Gly－Phe－Gly四肽連接子連接有效載荷。與抗HER2抗體偶聯(lián)產(chǎn)生的ADC在臨床環(huán)境中顯示出對抗HER2表達(dá)癌癥的巨大潛力。

DXd的環(huán)己胺環(huán)雖然被認(rèn)為穩(wěn)定了生物活性內(nèi)酯形式，但它攜帶了一個手性中心，使合成工作和SAR研究復(fù)雜化。為了克服這一困難，Immunogen的研究人員研究了一組新的喜樹堿類似物，這些類似物能夠與單抗偶聯(lián)。并且在這里，這個環(huán)被打開，額外的手性中心被消除。從一種常見的中間產(chǎn)物開始，研究人員嘗試了三種類型的結(jié)構(gòu)，并隨后使用不同的聚苯胺連接子連接有效載荷。當(dāng)與抗人表皮生長因子受體（HuEGFR）的抗體偶聯(lián)時，產(chǎn)生的ADC對EGFR陽性的HSC－2腫瘤異種移植模型有效。

卡奇霉素

卡奇霉素是一類被廣泛研究的烯二炔類抗生素，其結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制特別有趣和復(fù)雜，使其成為ADC有效載荷領(lǐng)域的一類抗生素。在ADC中連接calicheamicin的策略以市場上的adc Mylotarg為例，還有Besponsa。

有效載荷的釋放分兩步進(jìn)行：在酸性細(xì)胞內(nèi)環(huán)境中對腙進(jìn)行敏感的裂解，然后通過細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽還原二硫鍵。釋放的硫醇發(fā)生分子內(nèi)1，4－加成的烯酮觸發(fā)伯格曼環(huán)化反應(yīng)，產(chǎn)生一個二自由基。這種活性中間體能夠從脫氧核糖骨架中提取氫原子，產(chǎn)生雙鏈DNA斷裂，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

最近，從不列顛哥倫比亞地衣中發(fā)現(xiàn)的鏈霉菌中分離出一種新的烯二炔類天然產(chǎn)物，稱為uncialamycin。這種結(jié)構(gòu)通過全合成得到證實，從那時起，一些高效的合成類似物被制備成ADC的潛在有效載荷。

BMS的研究人員表明，由于在各種肽偶聯(lián)條件下反應(yīng)活性較低，因此，Uncialamycin的仲胺不是一個合適的連接點。研究人員合成了一種類似物，其中一個氨基直接引入到芳香環(huán)上，但這種苯胺的反應(yīng)性也太弱，不能作為連接子引入的基團(tuán)。另一方面，使用氨基乙基延伸物安裝脂肪族胺，為連接子提供了合適的連接點。

從后一個有效載荷中，他們使用蛋白酶可切割的二肽和不可切割的連接子制備前體。CD70－ADC具有可切割連接體，對腎癌細(xì)胞株具有高度特異性的細(xì)胞毒活性，而相應(yīng)的不可切割A(yù)DC在同一細(xì)胞株上不具有活性。

最近，為了繼續(xù)這項工作，BMS的研究人員在設(shè)計的、高效的、化學(xué)穩(wěn)定的uncialamycin類似物中使用苯酚基作為附著點。使用新開發(fā)的苯酚烷基化，在有效載荷的苯酚基團(tuán)上添加了一個經(jīng)典的可裂解連接子。將產(chǎn)生的有效載荷與抗體偶聯(lián)，其在體外和體內(nèi)均顯示抗原特異性抗腫瘤活性。

3． 創(chuàng)新藥物

凋亡誘導(dǎo)劑（Bcl－xL抑制劑）

抗凋亡Bcl－2家族成員（包括Bcl－xL）的過度表達(dá)是癌細(xì)胞獲得凋亡抵抗的機(jī)制之一。能夠阻斷Bcl－xL上BH3結(jié)合域的藥物可以觸發(fā)癌細(xì)胞凋亡。2017年，AbbVie首次以ADC的形式展示了BcL－xL抑制劑的有效載荷，其靶向表達(dá)EGFR的特定細(xì)胞或組織。有趣的是，研究人員在有效載荷上使用了三個不同的連接點來連接可切割的連接子。氨基烷基延伸的核心修飾用于在需要時建立合適的連接位點。

泰蘭司他丁及其類似物

靶向剪接體是一種參與mRNA加工的大型核糖核蛋白復(fù)合物，為靶向癌癥治療提供了一種有希望的治療選擇。有幾種天然產(chǎn)物能夠通過與不同的剪接體亞單位結(jié)合來抑制RNA剪接。最具代表性的是thailanstatin A，它可以與剪接體的SF3b亞單位結(jié)合，從而阻止RNA剪接。

Thailanstatin A缺乏一個適合連接連接子的基團(tuán)。為了解決這個問題，將羧酸與乙二胺偶聯(lián)以引入含有胺的間隔基，該間隔基通常用于連接子的安裝。

將這種天然產(chǎn)物用于ADC的另一個困難是存在多種反應(yīng)性功能。例如，中心核中的二烯可以通過Diels–Alder反應(yīng)與用于生物結(jié)合的馬來酰亞胺部分反應(yīng)。這個問題是通過使用另一個共軛部分，鹵代乙酰胺來解決的。結(jié)合這兩種修飾并包含可切割連接子的ADC首次在專利文獻(xiàn)中報道，并且聲稱它們在幾個表達(dá)HER2的細(xì)胞系中具有適度的活性。

最近，輝瑞報告說，羧酸直接與抗體的有效表面賴氨酸（無連接子偶聯(lián)）結(jié)合導(dǎo)致迄今為止最有效的Thailanstatin ADC。這些賴氨酸偶聯(lián)物的活性與藥物負(fù)載有關(guān)，而其他有效載荷類通常沒有觀察到這種特性。ADCs在胃癌異種移植模型中顯示出良好的作用。

鵝膏毒素

在ADC技術(shù)領(lǐng)域，使用類似amatoxins的轉(zhuǎn)錄抑制劑是一種相對較新的方法。九種天然存在的amatoxin衍生物具有相同的骨架結(jié)構(gòu)，一個由八個L－構(gòu)型氨基酸組成的大環(huán)，通過亞砜部分連接在色氨酸和半胱氨酸殘基之間。amatoxins的三個側(cè)鏈?zhǔn)橇u基化的，OH基團(tuán)具有良好的水溶性并與目標(biāo)分子結(jié)合。兩種肽，α－鵝膏糖蛋白和β－鵝膏毒素，占所有毒素的90％。

在amatoxins上共使用過三個附著點產(chǎn)生ADC。第一次嘗試是將β－鵝膏毒素的羧基偶聯(lián)到IgG上賴氨酸的氨基，這種連接具有良好的血漿穩(wěn)定性和高細(xì)胞毒性，但這種生物偶聯(lián)的產(chǎn)率很低。二氫異亮氨酸的羥基也被認(rèn)為是一個連接點，引入谷胱甘肽作為連接子，然后通過賴氨酸結(jié)合，可獲得體外細(xì)胞毒性和體內(nèi)抗腫瘤活性優(yōu)異的ADC，但不幸的是，由于血清羧酸酯酶裂解連接子，導(dǎo)致其循環(huán)穩(wěn)定性差。第三種方法，附著于色氨酸的6－羥基代表了目前的標(biāo)準(zhǔn)程序，苯酚與各種連接子的醚化導(dǎo)致了高度穩(wěn)定和有效的ADC。由于鵝膏毒素其它氨基酸要么不具化學(xué)活性，要么是與RNA聚合酶II結(jié)合的關(guān)鍵，因此不能將其它的鵝膏毒素氨基酸（即羥脯氨酸、甘氨酸、異亮氨酸和半胱氨酸）用于偶聯(lián)。

基于amanitin的代表性的ADC為HDP－101。有效載荷本身是一種合成的金剛烷醇衍生物，優(yōu)化了穩(wěn)定性。與天然天麻素相比，兩個差異是色氨酸中沒有6′－OH，硫醚鏈取代亞砜。通過天冬氨酸側(cè)鏈上酰胺的形成，引入組織蛋白酶B－裂解連接子。

最近，Park及其合作者為含苯酚的有效載荷設(shè)計了一種新的連接基序（OHPAS）。它是一種二芳基硫酸鹽，一個芳基部分來自有效載荷，另一個來自連接基序的潛在苯酚基團(tuán)。將該技術(shù)應(yīng)用于曲妥珠單抗ADC中的a－鵝膏毒素，在體外和體內(nèi)表現(xiàn)出強(qiáng)大的細(xì)胞毒性。

煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶

煙酰胺磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶（NAMPT）是一種負(fù)責(zé)將煙酰胺轉(zhuǎn)化為煙酰胺單核苷酸的酶，其抑制劑在各種臨床前和臨床研究中顯示出有效性，但其臨床應(yīng)用受到靶向毒性和劑量限制性毒性的限制，如血小板減少和胃腸道不良反應(yīng)。

諾華公司的研究人員在NAMPT抑制劑有效載荷中的苯環(huán)對位中引入哌嗪部分，確定了合適的連接子附著點。這種分子在c－Kit和HER2表達(dá)細(xì)胞系上表現(xiàn)出納摩爾水平的效力，并且耐受性良好，在體內(nèi)表現(xiàn)出靶向依賴性。

卡馬霉素

從庫拉索菌中分離得到兩種新的蛋白酶抑制劑，卡馬霉素A和卡馬霉素B。兩者都具有亮氨酸衍生的α，β－環(huán)氧酮彈頭直接連接到甲硫氨酸亞砜或甲硫氨酸砜。他們被發(fā)現(xiàn)能抑制釀酒酵母20S蛋白酶β5亞單位活性（糜蛋白酶樣活性）。此外，它們對肺癌和結(jié)腸癌細(xì)胞株具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性。

然而，由于它們的高效價，它們的選擇性較差，經(jīng)常表現(xiàn)出毒副作用。因此，劇毒的卡馬霉素衍生物適合作為ADC的彈頭，可以保持所需的效力，并獲得更好的耐受性。所設(shè)計的類似物均在P2位置并入砜甲硫氨酸衍生物（如卡馬霉素B），而不是卡馬霉素A中的亞砜甲硫氨酸，因為這消除了亞砜基立體異構(gòu)體混合物產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)復(fù)雜性。

第一代類似物在P4末端含有胺基，不幸的是，這個附著點并不合適，因為有效載荷顯示細(xì)胞毒性活性降低。第二代卡馬霉素類似物在P2側(cè)鏈上含有一個胺基，當(dāng)短乙基氨基鏈延伸磺酰基時，效果最好。在第三代類似物中，芳基連接砜和胺，因此降低了它的堿性。第二代和第三代有效載荷都顯示出強(qiáng)大的體外活性，并用可切割或不可切割的連接子連接。不幸的是，沒有一種ADC對受試癌細(xì)胞系表現(xiàn)出比曲妥珠單抗更高的細(xì)胞殺傷能力。

連接子

連接子不僅是抗體與小分子有效載荷之間形成共價連接的分子部分，而且是靶向藥物治療中具有設(shè)計性質(zhì)的關(guān)鍵元件。連接子的加入不應(yīng)誘導(dǎo)聚集，并且需要確?？山邮艿腜K特性，同時限制有效載荷在血漿中的過早釋放（穩(wěn)定性），并使活性分子在靶向作用位點有效釋放。連接子分為兩類：不可切割型和可切割型。

1． 不可切割連接子

基于不可切割的連接子的ADC必須被內(nèi)化，抗體部分需要被溶酶體蛋白酶降解以釋放活性分子。在ADC開發(fā)過程中已經(jīng)探索了許多不可切割的連接子，最具代表性的是N－琥珀酰亞胺基－4－（N－馬來酰亞胺甲基）環(huán)己烷－1－羧酸鹽（SMCC），Kadcyla就是使用的此類型連接子。

這種結(jié)構(gòu)的分解代謝導(dǎo)致Lys－SMC－DM1成為主要的腫瘤代謝物。此外，與這種連接子相連的藥物通常不能發(fā)揮旁觀者效應(yīng)，因為釋放的分解代謝產(chǎn)物通透性較差。目前的研究主要集中在可切割的連接子上。

使用可切割連接子對于具內(nèi)化和不具內(nèi)化ADC的設(shè)計同樣可行，因為釋放是由切割位點（溶酶體和／或腫瘤環(huán)境）的性質(zhì)觸發(fā)的。連接子可以分為兩大類：酶依賴性和化學(xué)（即非酶）依賴性。

2． 化學(xué)依賴性連接子

含有二硫鍵的連接子受到硫醇的親核攻擊以釋放活性載荷。盡管血漿中人血清白蛋白（HSA）的還原形式就是最豐富的硫醇，但它對大分子的反應(yīng)性很差。胞漿中還含有高水平的谷胱甘肽（GSH），這是一種含有巰基的三肽，很容易與S－親核蛋白發(fā)生反應(yīng)。血液（微摩爾范圍）和細(xì)胞質(zhì)（毫摩爾范圍）中GSH濃度的差異以及癌細(xì)胞引起的氧化應(yīng)激有助于藥物在癌細(xì)胞內(nèi)的優(yōu)先釋放。含有二硫鍵的連接子主要與maytansinoid類有效載荷相關(guān)。二硫鍵的反應(yīng)性可由空間位阻調(diào)節(jié)：α－甲基替換顯著影響還原速率和對硫醇－二硫鍵交換的抗性，如SAR－3419的連接子通過偕二甲基替換獲得SPDB－DM4最佳的抗腫瘤活性。

腙連接子顯示出依賴于pH的穩(wěn)定性，在中性pH下穩(wěn)定，并在酸性介質(zhì)中水解（內(nèi)體的pH＜6，溶酶體的pH＜5），形成相應(yīng)的酮和肼。

該方法已成功應(yīng)用于IMMU－110，包含一個可裂解?；赀B接子，由4－馬來酰亞胺甲基環(huán)己烷－1－羧酸鹽（MCC）的酰肼與阿霉素中存在的酮基反應(yīng)中形成。

腙連接體也經(jīng)常用于卡利霉素家族的有效載荷，在這種情況下，釋放是由兩步活化過程觸發(fā)的：第一步酸敏感腙被水解，第二步二硫鍵被GSH還原，使巰基中間體環(huán)化。這種連接子已經(jīng)在上市的Mylotarg和Besponsa中使用，但是它們在血漿中的穩(wěn)定性不如預(yù)期，也不如其他可切割連接子吸引人。

3． 酶依賴性連接子

為了限制有效載荷在內(nèi)化前的釋放，從而防止或最小化目標(biāo)細(xì)胞外的降解，溶酶體的蛋白質(zhì)組分成為尋找能夠降解ADC并以高濃度存在的酶的合理場所。

組織蛋白酶－B

組織蛋白酶B是一種半胱氨酸蛋白酶，存在于哺乳動物的晚期內(nèi)體和溶酶體中，在許多癌細(xì)胞中也過度表達(dá)。最初，一種可切割的二肽作為組織蛋白酶B的底物用作阿霉素前藥，這項工作建立了SAR的二肽部分：P1位置需要親水性殘基（瓜氨酸或精氨酸），而P2位置的親脂性殘基增強(qiáng)血漿穩(wěn)定性（苯丙氨酸、纈氨酸或丙氨酸）。

此外，還引入了一個自降解間隔子來促進(jìn)酶的進(jìn)入，從而限制了有效載荷的空間位阻：對氨基芐基氨基甲酸酯（PABA）在酸性介質(zhì)中自發(fā)1，6－消除，釋放二氧化碳、對氮雜醌甲酰胺和阿霉素。最終，這一發(fā)現(xiàn)從前藥轉(zhuǎn)移到ADC領(lǐng)域，證明了Val－Cit和Phe－Lys二肽連接子的抗原驅(qū)動的細(xì)胞活性。

Val－Cit二肽是ADCs中最常用的可裂解連接子，目前有多達(dá)25個分子處于臨床階段，可能是因為其整體良好的血漿穩(wěn)定性、釋放行為和化學(xué)可牽引性。兩個已獲批的ADC藥物（Adcetris和Polivy） 都使用了相同的連接子mc－VC－PABC，其中包含馬來酰亞胺基間隔子、作為組織蛋白酶底物的標(biāo)準(zhǔn)Val Cit二肽序列和PABC自降解間隔子。

Val－Ala二肽也被廣泛應(yīng)用，有7個分子處于臨床階段，進(jìn)展最快的是Loncastuximab tesirine，其包括一個聚乙二醇化間隔子，以平衡屬于PBD二聚體家族的有效載荷SG3199的親脂性。

研究表明，由于沉淀和聚集，Val－Cit很難實現(xiàn)高DAR。相反，Val－Ala連接子允許DAR高達(dá)7．4，且聚集有限（＜10％）。與Val－Cit相比，Val－Ala的疏水性較低，這解釋了為什么這種連接子在親脂性的有效載荷（如PBD二聚體）方面表現(xiàn)卓越，7個臨床候選ADC的Val－Ala連接子都連接PBD。

一些研究將Val－Cit和Val－Ala二肽結(jié)構(gòu)與MMAE的有效載荷連接進(jìn)行了比較。在非內(nèi)化抗體的情況下，結(jié)合到工程化半胱氨酸的Val－Cit和Val－Ala連接子都表現(xiàn)出類似的特征，并且比Val－Lys和Val－Arg類似物表現(xiàn)出更好的性能。在使用隨機(jī)半胱氨酸結(jié)合的抗Her2 ADC的情況下，與Val－Cit相比，Val－Ala在高DAR結(jié)構(gòu)中顯示出較少的聚集性。另一方面，兩種連接子顯示出相似的緩沖穩(wěn)定性、組織蛋白酶B釋放效率、細(xì)胞活性和組織病理學(xué)特征。

四肽Gly－Gly－Phe－Gly顯示出穩(wěn)定和有效的可切割連接子的所有特性，已上市的ADC藥物Enhertu使用了此類連接子。第一三共的Enhertu是一種血漿穩(wěn)定的ADC，DAR為7．7，在溶酶體中發(fā)生蛋白酶降解，釋放DX－8951f，這是一種有效的拓?fù)洚悩?gòu)酶I抑制劑，來源于exatecan。由于連接子不含增溶劑，達(dá)到如此高的DAR是非?？捎^的，因為它與廣泛確立的原理相矛盾，即高DAR結(jié)合物可能具有較差的藥代動力學(xué)特征。這里使用的自降解間隔子是簡單和緊湊的半胺化，而不是Val－Cit連接子使用的PABC。

磷酸酶和焦磷酸酶

與組織蛋白酶一樣，焦磷酸酶和磷酸酶也是在溶酶體中選擇性表達(dá)的水解酶。2016年，默克公司的研究人員設(shè)計了含有磷酸和焦磷酸的連接子與組織蛋白酶B敏感的Val－Cit－PABA搭配，旨在傳遞糖皮質(zhì)激素：磷酸鹽／焦磷酸鹽部分結(jié)合在自降解間隔子PABA和有效載荷之間。內(nèi)化后，有效載荷可通過組織蛋白酶B、自降解間隔子和磷酸酶（n＝1）的順序釋放。對于焦磷酸酯（n＝2），可能需要另一個涉及焦磷酸酶的步驟。

這種親水性和永久性帶電基團(tuán)的優(yōu)點是溶解性，不僅能夠與親脂性糖皮質(zhì)激素衍生物進(jìn)行生物偶聯(lián)，而且促進(jìn)ADC純化， ADC中的殘余連接子少于0．10％。含有磷酸和焦磷酸的ADC在體外都具有活性。

默克公司的同一組研究人員還開發(fā)了一種獨特的基于焦磷酸酶的連接子，用于釋放含羥基有效載荷地塞米松和丙酸氟替卡松。

此外，羥基附著點的性質(zhì)對有效釋放至關(guān)重要。地塞米松的伯醇效果良好，而更受阻的氟替卡松的仲醇需要一個縮醛間隔子，從而實現(xiàn)可接受的釋放。兩種ADC在體外均表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性，對腫瘤細(xì)胞系具有較強(qiáng)的活性。

β－葡萄糖醛酸酶

β－葡萄糖醛酸酶是一類糖苷酶，催化β－葡萄糖醛酸殘基的水解，它在溶酶體和腫瘤間質(zhì)中高表達(dá)。西雅圖遺傳學(xué)的研究人員于2006年發(fā)表了一項開創(chuàng)性的工作，抗CD70 ADC使用了含葡萄糖醛酸的連接子，葡萄糖醛酸附著在自降解間隔子上。這種連接子表現(xiàn)出低水平的聚集、高血漿穩(wěn)定性、以及強(qiáng)大的體內(nèi)功效。

該連接子還通過一個額外的二甲基乙二胺（DMED）自降解間隔子應(yīng)用于其他含胺的有效載荷，如喜樹堿類似物、SN38、杜卡霉素和苦參堿。釋放順序從水解β－葡萄糖醛酸到自降解間隔子，DMED的另一個環(huán)化反應(yīng)自發(fā)發(fā)生，形成1，3－二甲基咪唑啉－2－酮，并最終釋放含羥基藥物。由于連接子的親水性，與組織蛋白酶敏感連接子相比，該技術(shù)使ADC的DAR＝8制備更為容易。

β－半乳糖苷酶

最近報道了一種使用β－半乳糖苷酶裂解連接子的ADC，其中包含PEG10間隔子。間隔子被硝基取代，以提高自降解速率。類比β－葡萄糖醛酸酶連接子，其解離機(jī)制涉及水解β－半乳糖苷酶部分，它賦予化學(xué)前體親水性。另一個優(yōu)勢是β－半乳糖苷酶僅存在于溶酶體中，而β－葡萄糖醛酸酶在溶酶體中表達(dá)，也在實體瘤的微環(huán)境中表達(dá)。研究證明，在抗HER2－ADCs釋放MMAE的背景下，含β－半乳糖苷酶連接子的 ADC在體外和體內(nèi)均比T－DM1更為有效。

硫酸酯酶

最近，出現(xiàn)了硫酸酯酶裂解的連接子，硫酸酯酶在幾種癌癥類型中過度表達(dá)，表現(xiàn)出潛在的選擇性。研究涉及以MMAE為有效載荷的抗Her2抗體，與經(jīng)典的可切割Val－Cit和Val－Ala連接子相比，硫酸酯酶連接子對Her2＋細(xì)胞系顯示出相似的效力。

生物偶聯(lián)技術(shù)

1． 基于化學(xué)的特異性原位抗體修飾

單克隆抗體的天然結(jié)構(gòu)為生物偶聯(lián)提供了多種可能性，基于化學(xué)的、特異性的天然（非工程）抗體偶聯(lián)具有一些優(yōu)點。它可以避免抗體特定位點突變的復(fù)雜性，以及在細(xì)胞培養(yǎng)的放大和優(yōu)化方面可能面臨的挑戰(zhàn)。

偶聯(lián)位點根據(jù)抗體序列，賴氨酸、組氨酸、酪氨酸和半胱氨酸等內(nèi)源性氨基酸在二硫鍵間的連接位點非常具有吸引力。所有經(jīng)FDA批準(zhǔn)的ADC，直到2021年，都利用這些內(nèi)源性氨基酸進(jìn)行偶聯(lián)。然而，抗體支架還包含聚糖，這是在單克隆抗體生產(chǎn)過程中，F(xiàn)C區(qū)域的翻譯后修飾所導(dǎo)致的。一些研究報告了糖工程化的新策略，這似乎是一種有趣的生物偶聯(lián)替代方法。

與內(nèi)源性氨基酸的偶聯(lián)

最常見的偶聯(lián)方法之一是利用抗體的賴氨酸殘基，氨基酸親核NH2基團(tuán)與利克有效載荷上親電的N－羥基琥珀酰亞胺（NHS）基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)。盡管反應(yīng)簡單，但可利用賴氨酸殘基的高豐度導(dǎo)致了許多ADC在隨機(jī)分布下的不均勻混合物的形成。DAR受藥物／抗體化學(xué)計量比的控制，該方法得到廣泛應(yīng)用，包括已獲批的ADC，如Besponsa， Mylotarg， 和Kadcyla。

最近，同樣也報道了對賴氨酸位點和殘基的特異性修飾。通過計算機(jī)輔助設(shè)計，磺酰丙烯酸酯被用作中間試劑，用于在天然蛋白質(zhì)序列上對單個賴氨酸殘基進(jìn)行修飾。

反應(yīng)的區(qū)域選擇性歸咎于磺酰丙烯酸酯的設(shè)計以及每個賴氨酸周圍獨特的局部微環(huán)境。通過計算預(yù)測，pKa最低的賴氨酸容易以位點特異性的方式在弱堿性pH下優(yōu)先反應(yīng)。即使在其他親核殘基如半胱氨酸存在的情況下也觀察到了這種反應(yīng)。該技術(shù)已應(yīng)用于5種不同的蛋白質(zhì)和曲妥珠單抗，在偶聯(lián)后均保留了原有的二級結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)功能。

2018年，Rai等人報告了另一種利用“化學(xué)關(guān)鍵蛋白”的可逆分子間反應(yīng)進(jìn)行的位點特異性修飾。該試劑攜帶多種官能團(tuán)，這些官能團(tuán)在所有可獲得的賴氨酸殘基上可逆地形成亞胺部分。然后，關(guān)鍵蛋白通過試劑中的環(huán)氧化物與近端組氨酸殘基反應(yīng)。因此，在生理條件下，關(guān)鍵蛋白從賴氨酸中分離，醛被再生，從而能夠通過肟結(jié)合標(biāo)記抗體。

這種關(guān)鍵蛋白的定向修飾技術(shù)后來發(fā)展成單賴氨酸殘基標(biāo)記技術(shù)，即使在存在N－末端胺的情況下也具有毋庸置疑的選擇性。方法的成功依賴于Fk1－間隔子－Fk2試劑。

Fk1官能團(tuán)與賴氨酸可逆反應(yīng)，調(diào)節(jié)Fk2近端賴氨酸部分的微環(huán)境。然后通過酰胺鍵在Fk2處的賴氨酸殘基（K169和K395）進(jìn)行偶聯(lián)，間隔子的設(shè)計調(diào)節(jié)偶聯(lián)的位置。該方法已成功應(yīng)用于ADC（trastuzumab－emtansine）的合成，證明其細(xì)胞活性與已獲批準(zhǔn)的Kadcyla相當(dāng)。

Merlul等人最近報道了一種不同的結(jié)合策略，有效地靶向天然抗體上的組氨酸殘基。他們引入了一種基于陽離子有機(jī)金屬鉑（II）的連接子，［乙二胺鉑（II）］2＋，圖中表示為Lx。

這種技術(shù)基于絡(luò)合和偶聯(lián)兩個步驟。氮雜環(huán)配體如哌啶與Lx配位形成絡(luò)合物前體，穩(wěn)定的中間體包含有效載荷和配體上的一個氯離子。該復(fù)合物含有帶正電荷的Pt（II）中心，這提高了連接子和有效載荷復(fù)合物的水溶性并最小化抗體聚集，該方法還擴(kuò)展到類似的碘絡(luò)合物。在最近的一份報告中，碘化鈉的使用被證明可以顯著提高該技術(shù)的偶聯(lián)產(chǎn)率和選擇性。Cl－Lx－藥物載荷絡(luò)合物上殘留的氯配基與碘化物的交換生成更具活性的I－Lx－藥物載荷，從而獲得更高的偶聯(lián)產(chǎn)率。這項技術(shù)已被應(yīng)用于ADC藥物的大規(guī)模生產(chǎn)。

二硫化物重橋接策略

IgG抗體包含四個鏈間二硫鍵，兩個連接輕鏈和重鏈，兩個位于連接兩條重鏈的鉸鏈區(qū)，它們維持著單克隆抗體的完整性。另一個經(jīng)典的生物偶聯(lián)途徑探索了這些半胱氨酸作為有效載荷連接點的作用。四個二硫鍵的還原通常會產(chǎn)生八個巰基，它們能夠與馬來酰亞胺的連接子反應(yīng)，從而產(chǎn)生DAR為8的ADC。

Doronina及其同事報告了嵌合抗CD30單克隆抗體偶聯(lián)MMAE，DAR＝8的 ADC實例。與經(jīng)典的賴氨酸偶聯(lián)相比，這種有效載荷加載方式得到了更好的控制。然而，據(jù)報道，較高的藥物負(fù)荷會增加聚集的風(fēng)險，從而導(dǎo)致高血漿清除率，并降低體內(nèi)療效。

Badescu和al在2014年報告了一種新的位點特異性重橋接偶聯(lián)策略，他們是第一個證明新的雙砜（bis－sulfone）能夠烷基化來自抗體和抗體片段中還原二硫鍵的兩個巰基，對抗原結(jié)合的影響最小。后來，Wang和al描述了一種新的水溶性烯丙砜（allyl sulfone），該試劑在沒有原位活化的情況下提高了反應(yīng)活性。它表現(xiàn)出高穩(wěn)定性、高水溶性和位點特異性。

此外，還有巰基炔與末端炔烴和環(huán)辛炔生物偶聯(lián)的再橋接技術(shù)，其進(jìn)一步發(fā)展出新一代馬來酰亞胺，如二溴－（DBM）和二硫代馬來酰亞胺（DTM），用于位點特異性偶聯(lián)。這些馬來酰亞胺類似物在第3位和第4位含有良好的脫離基團(tuán)，從而實現(xiàn)快速、高效和高產(chǎn)率的偶聯(lián)。最近報道了結(jié)合二溴和二硫代馬來酰亞胺性質(zhì)的雜化硫代溴馬來酰亞胺（TBM），這種TBM試劑結(jié)合更快，顯示出更高的DAR＝4的百分比，這可能是由于溴減少了空間位阻。

2015年，Chudasama等人引入了一類新的重橋接試劑，二溴吡啶二酮（dibromopyridazinediones）。他們證明了它能有效地插入到二硫鍵中，得到的結(jié)構(gòu)即使在高溫下也表現(xiàn)出了極好的水解穩(wěn)定性。然而，隨著還原步驟上的溫度升高，也觀察到不均一性，這種結(jié)構(gòu)也允許選擇性地引入不同的功能基團(tuán)。

二乙烯基嘧啶（Divinylpyrimidine）是另一種有效的重橋接試劑，能夠產(chǎn)生穩(wěn)定的DAR＝4的ADC。Spring等人研究了乙烯基雜芳基支架對半胱氨酸再橋接的作用，他們認(rèn)為用嘧啶取代吡啶可以使雜芳環(huán)成為更好的電子受體，從而提高交聯(lián)效率。他們的工作擴(kuò)展到二乙烯基三嗪，在高溫下，重橋接顯示出更高的效率。

為了避免與經(jīng)典馬來酰亞胺偶聯(lián)相關(guān)的體內(nèi)不穩(wěn)定性的缺點，Barbas等人研究了甲基磺?；交鶒憾?，該試劑對半胱氨酸具有特異性反應(yīng)。與血漿中的半胱氨酸－馬來酰亞胺偶聯(lián)物相比，他們的穩(wěn)定性更高。受此啟發(fā)，Zeglis設(shè)計了DiPODS試劑，該試劑含有兩個通過苯基連接的惡二唑基甲基砜部分， DiPODS以重橋接的方式與兩個硫酸根形成共價鍵。與馬來酰亞胺偶聯(lián)相比，以這種方式偶聯(lián)具有優(yōu)越的體外穩(wěn)定性和體內(nèi)性能。

聚糖偶聯(lián)

由于IgG是一種糖蛋白，它在Fc片段每個重鏈的CH2結(jié)構(gòu)域N297位置包含一個N－聚糖，這種糖基化可以作為連接有效載荷的附著點。多糖與Fab區(qū)域間遠(yuǎn)距離定位降低了在偶聯(lián)后損害抗體的抗原結(jié)合能力的風(fēng)險，此外，與抗體的肽鏈相比，它們的化學(xué)組成不同，允許位點特異性修飾，使它們成為合適的偶聯(lián)位點。

聚糖生物偶聯(lián)可根據(jù)用于靶向碳水化合物的技術(shù)來區(qū)分：包括聚糖代謝工程化、聚糖氧化后的糖轉(zhuǎn)移酶處理、內(nèi)糖苷酶和轉(zhuǎn)移酶處理后的酮或疊氮化物標(biāo)記。

Neri等人報道了在IgG抗體的N－糖基化位點處巖藻糖的位點特異性修飾。這種糖含有一個順式二醇部分，適合選擇性氧化。他們用偏高碘酸鈉氧化巖藻糖殘基，生成一個能夠與含聯(lián)氨的連接子反應(yīng)的醛基，這樣，抗體通過腙鍵與藥物相連。

Senter及其同事向細(xì)胞培養(yǎng)基中添加硫基類似物，通過代謝將6－硫代巖藻糖帶入抗體修飾。他們認(rèn)為，取代是通過劫持巖藻糖基化途徑來完成的，這樣就引入了化學(xué)位點來實現(xiàn)位點特異性結(jié)合。與經(jīng)典半胱氨酸偶聯(lián)物相比，這種方法顯著降低了異質(zhì)性水平，并產(chǎn)生具有更可預(yù)測的藥動學(xué)和藥效學(xué)特性的偶聯(lián)物。

重組IgG中很少含有唾液酸，然而，已經(jīng)證明，利用半乳糖基和唾液酸轉(zhuǎn)移酶可以酶法改造甘氨酸。通過酶反應(yīng)添加半乳糖以獲得G2聚糖，然后添加末端唾液酸。這種修飾通過高碘酸氧化生成醛基，可以偶聯(lián)帶羥胺基團(tuán)的連接子－有效載荷。所得的偶聯(lián)物具有較高的靶向選擇性，體內(nèi)抗腫瘤活性良好。高碘酸還可氧化蛋氨酸等敏感氨基酸，影響與FcRn的結(jié)合。

除這些偶聯(lián)策略外，半乳糖殘基也可以作為修飾位點。多項研究報告了通過使用突變的β－ 1，4－半乳糖轉(zhuǎn)移酶，將半乳糖替換為一種含酮或疊氮官能團(tuán)的半乳糖，這種具有雙正交官能團(tuán)的半乳糖衍生物為高效偶聯(lián)開辟了途徑。這些技術(shù)已被開發(fā)用于成像和抗癌應(yīng)用。

從化膿性鏈球菌中發(fā)現(xiàn)的內(nèi)糖苷酶EndoS和EndoS2，這些酶能夠水解IgG的N－聚糖，從而使水解后的殘基成為生物偶聯(lián)的有效位點。這種方法有助于使單抗的聚糖結(jié)構(gòu)均勻化，同時它也適用于任何IgG亞型。此類方法應(yīng)用于trastuzumab－maytansine，制備出具有良好體外和體內(nèi)藥效的糖偶聯(lián)ADC。

2． 工程化抗體的位點特異性生物偶聯(lián)

生物正交化學(xué)和蛋白質(zhì)工程領(lǐng)域的進(jìn)展有助于產(chǎn)生更均勻的ADC。盡管在天然單抗上有許多可用的附著方法可供選擇，但在工程化抗體上的位點特異性生物偶聯(lián)能夠更有效地控制DAR，并且避免改變與抗原結(jié)合的親和力。這樣，在某些位置加入天然或非天然氨基酸，得到具有優(yōu)良藥代動力學(xué)和藥效學(xué)特征的同質(zhì)產(chǎn)品。

酶法

有效載荷的附著可以通過在抗體序列中插入特定的氨基酸標(biāo)簽以非常有選擇性的方式實現(xiàn)。這些標(biāo)簽被特定的酶所識別，例如甲酰甘氨酸生成酶（FGE）、微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶（MTG）、轉(zhuǎn)肽酶或酪氨酸酶，從而能夠執(zhí)行位點特異性偶聯(lián)。

Aaron等人探索了一種新的利用醛標(biāo)記蛋白質(zhì)的位點特異性偶聯(lián)。該技術(shù)利用了基因編碼的五肽序列（Cys－X－Pro－X－Arg），其中半胱氨酸殘基被FGE識別，并在細(xì)胞中蛋白質(zhì)表達(dá)期間被共翻譯氧化為甲酰甘氨酸。這樣，工程化抗體通過HIPS（hydrazino－Pictet–Spengler）化學(xué)方法與醛特異性連接子選擇性偶聯(lián)。

微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（MTGase）策略也經(jīng)常被開發(fā)用于定位特異性偶聯(lián)。MTGase催化在脫糖抗體295位置的谷氨酰胺側(cè)鏈與底物的伯胺之間形成肽鍵。與其他酶策略相比，MTG是一種靈活的技術(shù)，不需要肽供體來實現(xiàn)偶聯(lián)。只要?；荏w含有一種伯胺，就沒有結(jié)構(gòu)限制。

谷氨酰胺殘基自然存在于單抗的每個重鏈的Fc區(qū)域。在295位去糖基化后，谷氨酰胺殘基通過MTGase介導(dǎo)的反應(yīng)偶聯(lián)，可以產(chǎn)生均一的DAR＝2的ADC。為了提高效率，可以偶聯(lián)帶支鏈的連接子，從而使DAR翻倍，297位的天冬酰胺突變?yōu)楣劝滨０芬部稍黾覦AR。

NBE Therapeutics開發(fā)了基于S金黃色葡萄球菌轉(zhuǎn)肽酶A介導(dǎo)的偶聯(lián)。他們的策略利用轉(zhuǎn)肽酶A（SrtA），在LPXTG（X＝任何氨基酸）五肽的基序中切割蘇氨酸和甘氨酸殘基之間的酰胺鍵。然后，它催化甘氨酸相關(guān)的有效載荷與新生成的C－末端的偶聯(lián)，在生理溫度和pH下生成肽鍵。

該方法應(yīng)用于不同抗體，如抗CD30和抗Her2，并使用含有5甘氨酸標(biāo)記的連接子偶聯(lián)maytansine和MMAE，兩種ADC均顯示出與經(jīng)典偶聯(lián)相似的體外細(xì)胞殺傷活性。酶法產(chǎn)生的trastuzumab－maytansine在體內(nèi)試驗中完全匹配Kadcyla。

在另一個例子中，利用轉(zhuǎn)肽酶法生成了高效蒽環(huán)素毒素衍生物PNU－159682的ADC。有趣的是，通過這項技術(shù)，偶聯(lián)效率甚至高于Adcetris和Kadcyla類似物。此外，所制備的PNU－159682 ADC具有較高的體外和體內(nèi)穩(wěn)定性，并且顯示出的效力超過了含有微管蛋白靶向有效載荷的ADC。

另一個新興的新方法是通過酪氨酸標(biāo)簽進(jìn)行位點特異性抗體標(biāo)記，酪氨酸標(biāo)簽與單克隆抗體輕鏈的C末端基因融合?？紤]到位點可及性，Bruins及其同事使用了一種工程化的四甘氨酰酪氨酸殘基作為標(biāo)記，它為偶聯(lián)提供了一個容易觸及的位點。酪氨酸酶將酪氨酸氧化成1，2－醌，從而允許與各種雙環(huán)［6．1．0］壬炔（BCN）衍生物的環(huán)加成反應(yīng)。這種方法可以與含有BCN連接子的MMAE有效地偶聯(lián)。

半胱氨酸工程：硫單抗技術(shù)

隨機(jī)半胱氨酸偶聯(lián)和重橋接是利用抗體結(jié)構(gòu)內(nèi)天然存在的半胱氨酸殘基的技術(shù)。然而，隨機(jī)半胱氨酸方法的異質(zhì)性以及重橋接策略中的單抗片段化需要在ADC合成中加以考慮，特別是當(dāng)疏水性藥物被偶聯(lián)時。

與它們不同的是，硫單抗技術(shù)通過利用不涉及結(jié)構(gòu)二硫鍵的工程化反應(yīng)性半胱氨酸，在抗體上實現(xiàn)所需位點的選擇性和均勻修飾。一般來說，半胱氨酸突變的設(shè)計是為了促進(jìn)細(xì)胞毒性有效載荷偶聯(lián)的同時，保持單克隆抗體的穩(wěn)定性、親和力和最小化ADC聚集。為了確定突變的最佳位置，通常采用幾種技術(shù)，包括計算建模、模型系統(tǒng)篩選和高通量掃描。

Junutula等人首先報道了一種硫單抗策略，用工程化半胱氨酸殘基取代了抗MUC16抗體重鏈114位的丙氨酸（HC－A114），工程化位置內(nèi)的反應(yīng)性硫醇能夠與馬來酰亞胺負(fù)載的連接子反應(yīng)。合成的抗MUC16 ADC在異種移植小鼠模型中表現(xiàn)出效力，在大鼠和食蟹猴中表現(xiàn)出高劑量耐受性，這個發(fā)現(xiàn)建立了硫單抗偶聯(lián)策略的一般性方法。

此外，琥珀酰亞胺連接在胞漿內(nèi)可以經(jīng)歷兩個平行反應(yīng)：反向Michael反應(yīng)導(dǎo)致連接子－有效載荷的損失，以及琥珀酰亞胺的水解，這兩種反應(yīng)都對體內(nèi)ADC活性有顯著影響。為了提高穩(wěn)定性，Lyon和合作者設(shè)計了一個與馬來酰亞胺相鄰的堿性氨基整合進(jìn)來的連接子。在連接子中加入二氨基丙酸（DPR）促進(jìn)了硫琥珀酰亞胺在中性pH和室溫下的快速定量水解，這樣，非特異性的去偶聯(lián)作用被阻止，從而提高了體內(nèi)的穩(wěn)定性。除了常用的馬來酰亞胺外，還探索了不同的半胱氨酸反應(yīng)劑，如碘乙酰胺、溴甲酰胺、羰基丙烯酸酯，N－烷基乙烯基吡啶鹽。

3． 與工程化非天然氨基酸的生物偶聯(lián)

除了硫單抗技術(shù)外，非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸（ncAA）的加入為位點特異性偶聯(lián)提供了另一種可能性。該技術(shù)使用含有獨特化學(xué)結(jié)構(gòu)的氨基酸，從而能夠以化學(xué)選擇性的方式引入連接子－有效載荷復(fù)合物。該技術(shù)需要對抗體序列重組，利用與宿主細(xì)胞內(nèi)所有內(nèi)源性tRNAs和合成酶正交的tRNA和氨基酰tRNA合成酶（aaRS），用于響應(yīng)未賦值密碼子將ncAA帶入蛋白質(zhì)。通常，ncAA在發(fā)酵過程中被添加到培養(yǎng)基中。選擇非天然氨基酸是很重要的，因為它們可能激發(fā)免疫原性。常用的ncAA是具有獨特基團(tuán)的天然氨基酸的類似物，如酮、疊氮、環(huán)丙烯或二烯。

已有研究將對乙酰苯丙氨酸（pAcF）成功地整合入抗CXCR4 抗體中。有效載荷Auristin通過肟連接與抗體有效偶聯(lián)，從而生成化學(xué)均一的ADC。該ADC在小鼠體內(nèi)表現(xiàn)出良好的體外活性和完全清除肺腫瘤的作用。

由于肟連接所需的酸性條件和ADC緩慢釋放的動力學(xué)，另一種選擇是加入含ncAA的疊氮化物。廣泛應(yīng)用的對疊氮哌苯胺（pAzF）可在生理條件下快速進(jìn)行CuAAC或SPAAC反應(yīng)，利用這種策略成功地在抗CD74抗體上偶聯(lián)糖皮質(zhì)激素有效載荷。除了pAcF技術(shù)外，還成功地將含疊氮的賴氨酸類似物（AzK）帶入到抗體中，以產(chǎn)生具有Auristin、PBD二聚體或微管蛋白有效載荷的位點特異性ADC。

此外，賴氨酸的環(huán)丙烯衍生物（CypK）以及自然發(fā)生的非典型氨基酸，如硒代半胱氨酸（Sec）都成功地整合進(jìn)入抗體中。所產(chǎn)生的ADC表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性、選擇性以及體外和體內(nèi)活性。

ADC的相關(guān)內(nèi)吞途徑

一般來說，正常的內(nèi)吞作用可分為三個階段：（1）芽的形成，（2）膜的彎曲和囊泡的成熟，（3）膜的斷裂并釋放到細(xì)胞質(zhì)中。多種內(nèi)吞途徑有重疊的方面，因此內(nèi)吞的一般過程是高度靈活和復(fù)雜的。

網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用

網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用（CME）在概念上是一個簡單的過程，包括幾個連續(xù)和部分重疊的步驟。CME可由質(zhì)膜上的某些受體結(jié)構(gòu)性啟動，或者需要配體和／或抗體結(jié)合后啟動。當(dāng)細(xì)胞質(zhì)中的內(nèi)吞衣殼蛋白開始聚集在質(zhì)膜的內(nèi)小葉上時，CME就開始了。衣殼蛋白通過從細(xì)胞質(zhì)中招募并與額外的蛋白質(zhì)適配器相互作用而繼續(xù)組裝和生長。關(guān)鍵的銜接蛋白使膜彎曲，從而將內(nèi)化受體／配體集中到一個“網(wǎng)格蛋白包被坑”（CCP）中。由于CCP內(nèi)陷增大，CCP頸縮窄時，通過一個斷裂過程與質(zhì)膜分離。肌動蛋白聚合有助于將CCP向內(nèi)拉入細(xì)胞質(zhì)，直到斷裂完成，CCP釋放并成為一個網(wǎng)格蛋白包被的囊泡（CCV）。最后，CCV外殼被分解，CCV與內(nèi)涵體融合以運輸?shù)教囟ǖ膩喖?xì)胞位置，或者可以被回收回細(xì)胞表面。

網(wǎng)格蛋白是CME的關(guān)鍵成分，由重鏈和輕鏈組成。三個網(wǎng)格蛋白重鏈和輕鏈形成一個三聚體，它與其他三聚體相互作用，并在新興的CCP周圍形成一個多邊形晶格。銜接蛋白2（AP－2）是一種異源四聚體復(fù)合物，它介導(dǎo)CCP頸部的收縮。Dynamin是一種GTP酶，在成熟囊泡的頸部形成螺旋狀聚合物。GTP水解后，dynamin誘導(dǎo)囊泡從質(zhì)膜分裂。

小窩介導(dǎo)的內(nèi)吞作用

不依賴于網(wǎng)格蛋白的內(nèi)吞作用包括小窩介導(dǎo)的內(nèi)吞作用、小窩蛋白非依賴性載體蛋白／GPI－富集的早期內(nèi)區(qū)室（CLIC／GEEC）和巨胞飲作用。

小窩是質(zhì)膜的小瓶狀內(nèi)陷，其特征是高水平的膽固醇和鞘糖脂，通過不依賴于網(wǎng)格蛋白的途徑介導(dǎo)內(nèi)吞作用，并且存在于大多數(shù)細(xì)胞類型中。小窩的主要支架蛋白是小窩蛋白，它是形成寡聚體的20–24 kDa完整膜蛋白。小窩蛋白共享共同的支架結(jié)構(gòu)域，這些支架結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)與自身和其他包含小窩蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)的相互作用。

雖然小窩具有類似CCPs的內(nèi)陷形態(tài)，但它們是不同的。簡單地說，CCP的密度是恒定的，而小窩的密度會因細(xì)胞類型的不同而變化很大。CCPs隨著萌發(fā)的內(nèi)體成熟而增大，相比之下，小窩囊泡保持不變的大小。一旦進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，小窩就形成了高階結(jié)構(gòu)，而不是由CCPs形成的簡單的球形內(nèi)體。

小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用的另一個獨特方面是，只有約1％的小窩是從質(zhì)膜上萌發(fā)的。在一小部分內(nèi)化的小窩中，它似乎遵循一條與Rab5（早期內(nèi)胚體的標(biāo)志物）共定位的循環(huán)途徑。這可能對以利用小窩蛋白介導(dǎo)內(nèi)吞作用的受體為靶點的ADC帶來挑戰(zhàn)。

CLIC／GEEC內(nèi)吞作用

CLIC／GEEC是一種內(nèi)吞室，主要發(fā)生在配體激活的細(xì)胞中，這可能由生長因子、抗體的受體交聯(lián)或細(xì)菌毒素和病毒引起。此外，細(xì)胞膜必須處于高流動性狀態(tài)，因為CLIC／GEEC在低于生理溫度或膜處于更高張力的情況下不起作用。

CLIC在遷移細(xì)胞的前緣增加。識別CLIC／GEEC途徑的其他相關(guān)參數(shù)包括動力非依賴性質(zhì)膜斷裂、對膽固醇消耗的敏感性、Rab5／與早期內(nèi)體融合的獲得、胎盤堿性磷酸酶（PLAP）和與FAK相關(guān)的GTPase調(diào)節(jié)因子（GRAF1）。

巨胞飲作用

巨胞飲作用是一種更大規(guī)模的內(nèi)吞作用形式，通常涉及質(zhì)膜高度皺折的區(qū)域／突起，這些區(qū)域／突起隨后相互融合或與質(zhì)膜融合。膜皺褶是巨胞飲作用的形態(tài)學(xué)特征。

巨胞飲作用依賴于肌動蛋白聚合、Rac1蛋白和p21活化激酶1（PAK1）。PAK1是一個關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子，因為它與Rac1相互作用，Rac1激活磷脂酰肌醇－3－激酶（PI3K）、Ras、Src和Hsp90，以促進(jìn)巨胞飲作用。巨胞飲作用也是膽固醇依賴性的，這是招募Rac1所必需的。這些成分最終導(dǎo)致比CME和小窩蛋白更大吸收面積的內(nèi)吞作用。

ADC靶向抗原的內(nèi)吞特性

CD33

CD33是一種67kda跨膜糖蛋白受體，通常在正常髓系細(xì)胞上表達(dá)，由于其在AML細(xì)胞上優(yōu)先過表達(dá)，是GO的靶點。CD33的胞內(nèi)免疫受體酪氨酸基抑制基序（ITIM）調(diào)節(jié)CD33的內(nèi)吞作用，可通過CME激活內(nèi)吞作用。關(guān)于內(nèi)吞效率，AML細(xì)胞中CD33的表達(dá)水平與其內(nèi)吞率之間沒有相關(guān)性。CD33是一種緩慢內(nèi)化的抗原，此外，CD33交聯(lián)并不能改善內(nèi)吞作用。對GO無響應(yīng)的AML患者可能與CD33受體內(nèi)吞的功能低下有關(guān)。

CD30

CD30是一種120kda跨膜糖蛋白，屬于腫瘤壞死因子受體（TNFR）超家族。其細(xì)胞外部分由六個擴(kuò)展構(gòu)象的富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域（CRD）組成。CD30在活化的T細(xì)胞和B細(xì)胞以及各種淋巴腫瘤（包括霍奇金淋巴瘤和ALCL）上表達(dá)。

CD30不具有內(nèi)吞作用，相反，它因蛋白水解裂解而脫落，CD30的脫落由基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）介導(dǎo)。脫落是CD30生物學(xué)的一個特征，高濃度的循環(huán)可溶性CD30可以作為監(jiān)測腫瘤進(jìn)展的血清標(biāo)志物。對于ADC的療效，升高的CD30循環(huán)水平似乎會隔離注射的ADC，從而減少能夠定位于CD30陽性腫瘤部位的ADC的數(shù)量。因此，缺乏內(nèi)吞作用的結(jié)果表明CD30不是理想的ADC靶點。

CD22

CD22是一種140 kDa的跨膜糖蛋白，與CD33一樣，它也是Siglec家族的成員，并與該家族共享多種結(jié)構(gòu)特征。關(guān)鍵的區(qū)別在于CD22比CD33大得多，因為它有多個Ig結(jié)構(gòu)域和ITIM／ITIM樣基序。CD22的表達(dá)僅限于B細(xì)胞，CD22在各種B細(xì)胞惡性腫瘤（包括ALL）的大多數(shù)母細(xì)胞中表達(dá)水平升高。

CD22通過CME進(jìn)行內(nèi)吞作用。類天然配體通過CD22的結(jié)構(gòu)性快速內(nèi)吞在細(xì)胞內(nèi)積聚。這些配體在溶酶體中被分類降解，而CD22則循環(huán)回到細(xì)胞表面。此外，CD22配體誘導(dǎo)的內(nèi)吞激活細(xì)胞內(nèi)池，補(bǔ)充或增加細(xì)胞表面CD22的表達(dá)水平。因此，CD22對ADC具有良好的內(nèi)吞特性。

CD79b

CD79b僅在未成熟和成熟的B細(xì)胞中表達(dá)，在惡性腫瘤≥80％的B細(xì)胞中過表達(dá)。CD79a和CD79b是兩種非共價結(jié)合的跨膜蛋白，介導(dǎo)信號傳導(dǎo)和內(nèi)吞作用。對于后者，CD79a－CD79b異二聚體是控制BCR內(nèi)吞的支架。BCR內(nèi)吞作用主要由CME完成，并由AP－2介導(dǎo)。有趣的是，CD79a直接與AP－2的μ亞單位相互作用，進(jìn)而激活CD79b并導(dǎo)致整個BCR復(fù)合物的內(nèi)吞。

此外，對于ADC來說，CD79a可以作為單體內(nèi)化，但CD79b卻不能。如果CD79b的近端膜酪氨酸（Y195）發(fā)生突變，AP－2與CD79a的結(jié)合就會被阻斷，內(nèi)吞也被阻斷。在18％的活化B細(xì)胞樣DLBCL標(biāo)本中，Y195發(fā)生突變?？傊凶C據(jù)表明CD79b其內(nèi)吞活性依賴于整個BCR復(fù)合體的內(nèi)化，而不是作為單體的內(nèi)化。

TROP－2

Trop2是一種46kDa的單體糖蛋白，具有選擇性過度表達(dá)、結(jié)構(gòu)性內(nèi)吞作用和導(dǎo)向溶酶體等特性，使其成為ADC的一個非常有吸引力的靶點。Trop2的內(nèi)化機(jī)制與CME有關(guān)。

觀察到的Trop2強(qiáng)大的內(nèi)吞作用，一種潛在的解釋可能是由于顯著的Trop2聚集。研究Trop2的構(gòu)象動力學(xué)，發(fā)現(xiàn)Trop2通過位于跨膜結(jié)構(gòu)域的氨基酸“VVVVV”組成的相互作用片段形成天然的同型二聚體。Trop2的二聚作用可以通過其他細(xì)胞表面蛋白質(zhì)進(jìn)一步將Trop2單體招募到更接近的位置。因此，Trop2簇很可能由多個二聚體通過脂筏和其他膜結(jié)合蛋白連接而成。

Trop2與多種配體結(jié)合，如claudin－1、claudin－7、cyclin D1和IGF1，然而，這些配體都沒有證明在與Trop2結(jié)合或相互作用時被內(nèi)化。因此，與正常細(xì)胞相比，Trop2在腫瘤細(xì)胞中發(fā)生的內(nèi)吞作用更為強(qiáng)烈，這些都表明Trop2是ADC的一個很好的靶點。

BCMA

BCMA或CD269，也稱為TNFR超家族成員17，轉(zhuǎn)導(dǎo)誘導(dǎo)B細(xì)胞存活和增殖的信號。BCMA的分子量僅為20．2 kDa，其配體結(jié)合的胞外區(qū)域具有“臂椅”構(gòu)象，由六個CRD組成。除了多發(fā)性骨髓瘤外，BCMA還表達(dá)于許多血液系統(tǒng)惡性腫瘤，如霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤。

然而，關(guān)于BCMA所利用的精確內(nèi)吞途徑的知之甚少。與內(nèi)吞作用有關(guān)，唾液酸化是一種調(diào)節(jié)功能，它可能誘導(dǎo)BCMA利用CME發(fā)生內(nèi)吞作用。

HER2

HER2是一種185kda跨膜糖蛋白，屬于EGFR家族。HER2／neu基因的擴(kuò)增是已知的人類惡性腫瘤和轉(zhuǎn)移的驅(qū)動因素。由于HER2在癌癥中的作用，幾十年來一直被作為治療靶點。HER2也一直是ADCs的靶點，T－DM1和T－DXT都被批準(zhǔn)用于HER2陽性轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者。

HER2的內(nèi)吞存在多種機(jī)制，首先是CME，共免疫沉淀清楚的顯示HER2直接與AP－2結(jié)合，此外，dynasore能完全阻斷SKBR3細(xì)胞的HER2內(nèi)吞作用；其次小窩蛋白結(jié)合基序φxφxxxxφ（φ代表芳香族氨基酸Trp、Phe或Tyr）通常存在于小窩蛋白相關(guān)蛋白上，有趣的是，序列WSYGVTIW已在HER2的細(xì)胞內(nèi)激酶結(jié)構(gòu)域中被鑒定出；另外，有研究證明HER2可以利用CLIC／GEEC的內(nèi)吞途徑。

這些不同的發(fā)現(xiàn)揭示了HER2內(nèi)吞的重要特征。首先，HER2的內(nèi)吞作用是混雜的，其次，小窩介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑似乎更常被利用。

Nectin－4

Nectin－4是一種66 kDa 的I型跨膜蛋白，其主要作用是促進(jìn)細(xì)胞間的接觸。Nectin－4作為ADC靶點很有吸引力，因為研究表明，它在幾種腫瘤類型中過表達(dá)，但在正常成人組織中幾乎不存在。

目前，沒有發(fā)現(xiàn)天然配體或mAb／ADC與nectin－4的復(fù)合物內(nèi)吞的信息，但是可以借鑒nectin－4結(jié)合病原體內(nèi)吞的研究。Nectin－4也是麻疹病毒的受體，研究表明，麻疹病毒通過巨胞飲作用進(jìn)入MCF7、HTB－20乳腺癌和DLD－1結(jié)直腸癌細(xì)胞。病毒進(jìn)入需要PAK1，相反，dynamin抑制劑Dynasore對病毒進(jìn)入沒有影響。此外，表達(dá)顯性負(fù)性小窩蛋白的細(xì)胞并不能消除病毒的內(nèi)吞作用。

基于這些間接研究，nectin－4表現(xiàn)出病毒受體所需的強(qiáng)大的內(nèi)吞活性。

ADC的藥代動力學(xué)

藥代動力學(xué)是臨床藥理學(xué)和現(xiàn)代藥物開發(fā)過程中不可缺少的一部分。應(yīng)該認(rèn)識到，與小分子和治療蛋白（抗體或融合蛋白）不同，ADC的PK非常復(fù)雜，因為ADC由幾個組成部分組成。不僅要考慮單抗的PK，還要考慮細(xì)胞毒性分子的PK以及結(jié)合的物化性質(zhì)。由于單抗的分子量占到了90％以上，因此ADC的不同組分的PK受其PK的影響很大?？偪梗ˋDC＋mAb）的PK特征提供了ADC穩(wěn)定性和完整性的最佳評估。偶聯(lián)物和偶聯(lián)位點在維持ADCs的穩(wěn)定性和PK中也起著重要作用。下表列出了FDA批準(zhǔn)的ADC及其PK的特性。

一般來說，AD在給藥后，體內(nèi)涉及四個過程。這些過程是吸收、分布、代謝和清除。大多數(shù)抗體通常通過靜脈注射或輸液途徑給予，抗體也可以通過皮下（SC）途徑給予。然而，對于ADC，目前給藥途徑是靜脈注射或輸液。由于對細(xì)胞毒性有效載荷的反應(yīng)和細(xì)胞毒性物質(zhì)的局部沉積，SC給藥可能不適用于ADC。

藥物在體內(nèi)的分布可以用分布容積來描述。由于其大小和極性，抗體和ADC的分布通常局限于血管和間質(zhì)間隙。ADCs的初始分布一般局限于血管，其分布容積一般等于血容量。隨后，ADCs可以分布到間質(zhì)間隙。此外，ADC分布也會受到靶抗原表達(dá)和內(nèi)吞的影響。ADC在同一組織中的分布和積累會產(chǎn)生不良的（毒性）藥理學(xué)影響，這是由于ADC的攝取后的細(xì)胞毒性藥物或代謝物的釋放。

ADC體內(nèi)分解／代謝過程包括抗體分解代謝過程和小分子藥物體內(nèi)代謝。ADCs在到達(dá)腫瘤細(xì)胞前，在細(xì)胞內(nèi)（non－cleavable linker）或者循環(huán)系統(tǒng)中（cleavable linker）釋放效應(yīng)分子，未結(jié)合的抗體和抗體片段遵循抗體的代謝途徑通過酶解產(chǎn)生氨基酸，被機(jī)體重新利用。

ADC裂解或被分解代謝后可能形成的游離的小分子藥物和／或連有氨基酸殘基的小分子藥物和／或linker的小分子藥物代謝物，會進(jìn)一步經(jīng)歷肝CYP450酶代謝，還可能發(fā)生潛在的藥物藥物相互作用。除了ADC本身性質(zhì)外，抗原的表達(dá)、受體／細(xì)胞密度，F(xiàn)cRn介導(dǎo)的循環(huán)作用、與Fcγ作用、受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用、免疫原性等都會影響ADC的分解代謝。

ADC也是通過分解代謝和排泄的方式進(jìn)行消除。ADC可通過與靶點結(jié)合的特異途徑，進(jìn)入溶酶體后發(fā)生降解，釋放小分子藥物后從體內(nèi)清除；還可以通過非特異的胞飲作用進(jìn)行清除，該途徑涉及新生兒受體（FcRn）參與的循環(huán)再利用過程。

ADC、抗體、分子量較大的多肽及氨基酸片段無法通過腎小球濾過排泄，而是以氨基酸的形式重新吸收利用。游離小分子藥物、分子量較小的多肽及氨基酸連接的小分子藥物、分子量較小的抗體片段可通過腎小球濾過進(jìn)行排泄。同時，小分子藥物及代謝產(chǎn)物也可經(jīng)酶代謝消除或通過轉(zhuǎn)運體排泄至糞便中。

ADC的免疫原性

在針對8個ADC的11個臨床試驗中， ADAs的基線發(fā)生率在1．4％到8．1％之間，基線后ADAs的發(fā)生率在0－35．8％之間，這些數(shù)值在治療性單克隆抗體的范圍內(nèi)?？偟膩碚f，ADCs的ADA發(fā)生率在靶向血液腫瘤的患者比靶向?qū)嶓w腫瘤的患者少；大多數(shù)ADA是針對ADC的單克隆抗體結(jié)構(gòu)域的。此外，在大多數(shù)患者中，這些ADC的半抗原樣結(jié)構(gòu)并不比治療性單克隆抗體產(chǎn)生更多的免疫應(yīng)答風(fēng)險。

小結(jié)

盡管第一個ADC在20多年前就獲得了FDA的首次批準(zhǔn)，但制藥行業(yè)必須經(jīng)歷一個漫長且乏味的學(xué)習(xí)過程，才能在市場和臨床開發(fā)中獲得一條穩(wěn)定的ADC管線。盡管目前已有13種已批準(zhǔn)的ADC，但是由于ADC的技術(shù)進(jìn)步，該領(lǐng)域正在經(jīng)歷一次爆發(fā)，我們在有效載荷，連接子和偶聯(lián)技術(shù)方面獲得了多個突破，進(jìn)一步加深了對ADC這種新型藥物的全面認(rèn)識。

此外，藥物劑量－暴露－效應(yīng)關(guān)系的確定是ADC成功的關(guān)鍵，內(nèi)吞作用是這種關(guān)系的關(guān)鍵部分，對于優(yōu)化給藥方案以最大限度地提高治療指數(shù)非常重要。然而盡管目前ADC領(lǐng)域如火如荼，但是我們對靶受體的內(nèi)吞作用仍知之甚少。另外，許多內(nèi)吞作用的核心成分和關(guān)鍵的效應(yīng)器非常重要，然而這些蛋白可能在癌癥中普遍發(fā)生突變，這也會影響ADC內(nèi)吞作用和療效。相信隨著該領(lǐng)域的發(fā)展，經(jīng)過無數(shù)次積累的經(jīng)驗，ADC終會迎來真正的春天。

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關(guān)鍵詞： 有效載荷 內(nèi)吞作用 半胱氨酸